在比較配對檢體之蛋白質的差別，下列何種分離方法可以最有效減少操作過程的誤差？

本題觀念：

比較配對檢體之蛋白質差異時，要顧慮不同樣本在分離與顯像過程中所產生的「gel-to-gel variation」與操作誤差。傳統 2D-PAGE 雖能高解析分離蛋白，但分別於多張凝膠上電泳、後製染色與比對時，因凝膠批次與處理步驟差異造成定量誤差；而 2D-DIGE（fluorescent two dimensional difference in-gel electrophoresis）將不同樣本先以波長可區分的 CyDye 螢光染劑分別標示，再混合同膠電泳並利用內部標準池做正規化，可最大幅度降低實驗變異。

選項分析

• 選項A：二維電泳分析（2D-PAGE）

  • 核心原理：IEF 第一維依 pI 分離，SDS-PAGE 第二維依分子量分離，後製染色 (Coomassie／銀染) 後影像比對。
  • 問題：不同凝膠之間 pH 梯度、聚丙烯醯胺濃度、電場均一性、染色／顯像條件差異大，spot 位置與強度的 gel-to-gel variation 高 (CV 可達 55–80%)，需多張技術複本且耗時費力 (openprairie.sdstate.edu)。

• 選項B：磁珠親和分離法（Bead-based affinity fractionation）

  • 核心原理：利用磁珠表面配體（如抗體、金屬螯合）富集目標蛋白或胜肽。
  • 問題：雖適用於目標蛋白純化及質譜前處理，但對全蛋白組差異定量需重複多步綁定／洗脫，每步可能引入不均一性；且不含內部標準，無法同膠消除系統性誤差 (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

• 選項C：螢光染劑標示二維凝膠電泳（fluorescent 2D-DIGE）

  • 核心原理：先以 Cy2/Cy3/Cy5 等不同色染劑標示各樣本（含一個由所有樣本混合而成之內部標準池），混合後於同張凝膠同步電泳，最後以波長分別掃描成像；內部標準用以正規化所有 spot 強度，消除膠間與操作差異。
  • 優勢：同時分析多個樣本於單一凝膠，完全消除 gel-to-gel variation；定量敏感度可達 0.2 fmol、差異 ±15% 皆可可靠檢出；CV 可由傳統 2D-PAGE 的 ~55% 降至 ~33% (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

• 選項D：膠體過濾層析法（gel filtration chromatography）

  • 核心原理：依蛋白質大小排阻分離，樣本需分批經同一柱體。
  • 問題：受管柱裝填、流速、延滯體積等參數影響大，重現性不如 2D-DIGE；解析度與定量能力不足以比較配對樣本間細微差異。

答案解析

2D-DIGE 利用螢光染劑前標示、多色波長掃描與內部標準池做正規化，讓不同樣本在同一凝膠中並行電泳，徹底消除傳統 2D-PAGE 的 gel-to-gel variation 及操作誤差；同時保持高解析度與靈敏度，是比較配對檢體蛋白差異時最能減少實驗誤差的分離方法，故選 C (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)。

核心知識點

• 2D-PAGE：IEF + SDS-PAGE 分離原理、後製染色、gel-to-gel variation 高。
• 2D-DIGE：前染色 (CyDye) + 多色混合電泳 + 內部標準池（normalization pool）→ 同膠消除系統誤差，CV 由 ~55% 降至 ~33%；檢出限 0.2 fmol、差異 ±15% 可量化。
• Bead-based affinity：適合目標純化，多步驟洗脫易增誤差，無同膠正規化機制；
• Gel filtration：尺寸排阻分離，柱參數變異大，解析度不及 2D-DIGE。
• gel-to-gel variation 來源：凝膠成分、電場、梯度、後製處理、影像比對。
• DIGE 成像與分析軟體：DeCyder 等可自動 spot matching 與量化，提升重現性。

臨床重要性

臨床蛋白質體學研究（如生物標誌物發現、疾病機制探討）需高度定量重現性。2D-DIGE 技術確保配對檢體微小差異可被偵測，降低實驗誤差，提高研究結果可靠度與可重複性。