下列何者是Ziehl-Neelsen stain所需的試劑和正確染色步驟？①3% HCl-ethanol　②carbolfuchsin③1% NaOH-ethanol　④methylene blue

本題觀念：

Ziehl–Neelsen acid-fast stain原理在於Mycobacteria細胞壁中高量mycolic acid會牢固結合carbolfuchsin，透過加熱驅動染劑進入細胞後，在酸性酒精（acid‐alcohol）脫色時抗酸性菌保留紅色，其他非酸性菌失色，再以methylene blue做counterstain，形成紅色菌體配藍色背景。

選項分析

• 選項A (①②③)：包含3% HCl-ethanol與carbolfuchsin，但誤加了1% NaOH-ethanol，且無counterstain步驟，非Ziehl–Neelsen protocol，錯誤。
• 選項B (②①④)：順序為carbolfuchsin → 3% HCl-ethanol → methylene blue，正好對應primary stain、decolorizer、counterstain三步驟，符合Ziehl–Neelsen方法，正確。
• 選項C (④③②)：先用methylene blue再用1% NaOH-ethanol，最後才carbolfuchsin，步驟顛倒且缺acid‐alcohol脫色，完全不符，錯誤。
• 選項D (②③①④)：雖以carbolfuchsin起始，但中間誤用1% NaOH-ethanol再才用3% HCl-et

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