112年:(醫檢)檢驗(1)
關於聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)的實驗設計,下列何者最正確?
A引子(primer)的序列是根據所偵測之 DNA模板的序列來設計
B黏合(annealing)溫度是依照 DNA 模板的序列計算後設定
C所使用鎂離子的濃度愈高,特異性產物比例愈多
D延伸(extension)時間是依照引子(primer)的序列計算後設定
詳細解析
本題觀念:
聚合酶連鎖反應(PCR)中,關鍵參數之實驗設計原理,包括引子(primer)序列設計、黏合(annealing)溫度設定、鎂離子(Mg2+)濃度對特異性與產率之影響,以及延伸(extension)時間與產物長度的關係。
選項分析
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選項A
引子必須與目標 DNA 模板具互補序列以便在黏合階段能特異結合,故 primer 序列一定要根據所欲擴增的模板序列來設計。引子一般長度約 18–30 nt,需避免自身形成髮夾或二聚體,且引子 3′ 端需與模板完全匹配,才能供 DNA polymerase 延伸起始 (parts.igem.org)(github.com)。 -
選項B
黏合溫度並非直接根據 DNA 模板序列本身計算,而是根據 primer 的熔解溫度(Tm)設定。常見經驗法則為將黏合溫度設於較低 primer Tm 約 3–5°C(或利用加權公式 Ta = 0.3 × Tm(primer) + 0.7 ×
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