承上題【以次世代定序（next-generation sequencing, NGS）進行實體腫瘤組織樣本突變檢測，並用桑格定序法（Sanger sequencing）進行確認；結果如圖所示：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是四個單一核苷酸變異（single nucleotide variation,SNV）位點，下列那一個變異位點最有可能是種系突變（germline mutation）？】，臨床檢驗實務上， 如果要更進一步確認該變異位點確實為種系突變，下列何種驗證最有效？

本題觀念：

本題考察如何從腫瘤組織NGS檢測結果及Sanger定序確認中，藉由變異等位基因頻率（MAF）與腫瘤細胞含量的關係，鑑別體細胞（somatic）及種系（germline）突變，並探討在臨床檢驗實務中，最有效的種系突變確認策略。

影像分析：

圖表呈現Ⅰ～Ⅳ四個SNV位點在同一實體腫瘤樣本中的檢測結果。

1. Sanger（S）與NGS（N）偵測：
   • Ⅰ～Ⅲ位點：NGS呈現陽性（N黑色），但Sanger均未偵測（S白色）。
   • Ⅳ位點：NGS與Sanger均呈陽性（黑色）。
2. NGS測序深度：Ⅰ約10×、Ⅱ約100×、Ⅲ約1,000×、Ⅳ約10,000×，顯示檢測靈敏度分別。
3. 腫瘤細胞含量：Ⅰ約20%、Ⅱ約30%、Ⅲ約60%、Ⅳ約80%。
4. 變異等位基因頻率（MAF）：
   • Ⅰ～Ⅲ互呈明顯與腫瘤含量成正比，分別約10%、15%、30%。
   • Ⅳ位點MAF穩定在約50%，與腫瘤含量無關。
     此特徵顯示Ⅰ～Ⅲ為體細胞突變（VAF ≈ 純化腫瘤×0.5），而Ⅳ位點符合種系雜合突變（異質體）約50%頻率，Sanger能偵測亦支持高頻率。

選項分析

• 選項A 重複NGS檢驗
  僅驗證實驗再現性，仍來自同一腫瘤DNA；無助於鑑別是否存在於全身細胞中的種系突變。

• 選項

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