進行次世代定序的主要步驟包括：① PCR 增幅 ②定序 ③結果分析 ④文庫建構，下列何種順序最適當？

本題觀念：

次世代定序(Next-Generation Sequencing, NGS)流程包含文庫建構(library construction)、PCR增幅(clonal or library amplification)、定序(sequencing)以及生物資訊結果分析(data analysis)。本題考察這些步驟的正確先後順序。

選項分析

• 選項A (①→②→④→③)：
  若依此順序，先做PCR增幅，再定序，之後才做文庫建構，最後才結果分析。實務上必須先完成文庫建構才能進行PCR增幅，故此排序錯誤。

• 選項B (②→③→④→①)：
  先做定序與結果分析，再做文庫建構與PCR增幅，完全違反實驗流程，錯誤。

• 選項C (④→①→②→③)：
  依序先做文庫建構，包括DNA片段化、接頭(adapter)接合；接著以PCR富集並產生足量片段；然後上機定序；最後進行資料處理與分析。符合NGS作業流程([thermofisher.com](https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/next-generation-sequencing/il

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