115年:(醫檢)檢驗(1)
下列何種發生在限制酶辨識序列上的基因變異，最不適合運用restriction fragment length polymorphism（RFLP）進行檢測？
Abase substitution
Bdeletion 或insertion
Csequence rearrangement
Dgene amplification
詳細解析
本題觀念：
限制片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一種分子生物學技術，其核心原理是利用限制酶（Restriction Enzyme）去辨識並切割特定的DNA序列（Recognition sequence）。當DNA序列發生變異（如鹼基置換、缺失、插入或重組），導致限制酶的切割位點（Restriction site）產生、消失或位點間的距離改變時，經切割後的DNA片段長度就會發生改變。透過電泳分析這些不同長度的片段，即可檢測出基因變異。
選項分析
- A. Base substitution（鹼基置換）：適合。
- 這是RFLP最經典的檢測標的之一（即SNP-RFLP）。若鹼基置換發生在限制酶的辨識序列上（例如由
GAATTC變為CAATTC），會導致該切割位點消失（loss of site），使得原本應該被切開的兩個片段變成一個大片段；反之亦然。這種長度的改變（Polymorphism）非常容易利用RFLP偵測。
- 這是RFLP最經典的檢測標的之一（即SNP-RFLP）。若鹼基置換發生在限制酶的辨識序列上（例如由
- B. Deletion 或 Insertion（缺失或插入）：適合。
- 若插入或缺失發生在辨識序列內部，會破壞該位點導致無法切割，改變片段長度。
- 若插入或缺失發生在兩個切割位點之間，會直接改變被切下的片段長度（變大或變小）。這也是RFLP常用的檢測原理（例如檢測帶有Indel的變異）。
- C. Sequence rearrangement（序列重組）：適合。
- 序列重組（如倒轉 Inversion、易位 Translocation）會大幅改變基因組的結構，導致限制酶切割位點的相對位置發生改變，從而產生與正常基因組完全不同的片段長度圖譜。Southern Blot (RFLP的後續步驟) 常用於偵測此類大片段重組。
- D. Gene amplification（基因擴增）：最不適合。
- 定義不符：題目限定變異是「發生在限制酶辨識序列上」。基因擴增（如癌症中的 HER2 基因擴增）是指特定基因的拷貝數（Copy number）增加，通常涉及大片段DNA的複製，而非單一限制酶辨識序列內的微小變異。
- 檢測原理不符：RFLP檢測的是「片段長度」的差異（Length Polymorphism）。在基因擴增中，若擴增的基因序列本身沒有發生突變，其內部的限制酶切點位置與距離將保持不變。因此，酶切後產生的片段長度（大小）不會改變，改變的僅是片段的數量（電泳條帶的亮度增強）。雖然可以透過定量分析亮度來推測擴增，但這不屬於「長度多態性」的範疇，且不如 qPCR 或 FISH 等技術準確。
答案解析
正確答案是 D。
RFLP 技術依賴於 DNA 序列變異導致的「酶切片段長度改變」。選項 A、B、C 均能直接改變限制酶切位點的有無或位點間的距離，進而產生長度不同的 DNA 片段，符合 RFLP 的檢測原理。而 Gene amplification (D) 僅是基因數量的增加，酶切後的片段大小通常不變（僅訊號增強），且該變異本質上並非發生在「單一限制酶辨識序列」上的序列錯誤，因此最不適合用旨在分析「長度多態性」的 RFLP 技術進行檢測。
核心知識點
- RFLP 原理：利用限制酶切割DNA，偵測因序列變異（Mutation/SNP）導致的切割位點改變（位點獲得/缺失）或片段長度改變（Insertion/Deletion/Rearrangement）。
- RFLP 適用範圍：
- 點突變 (Point Mutation/SNP)：必須位於限制酶辨識位點內才可偵測。
- 小片段插入/缺失 (Indel)：位於位點內或兩位點間均可偵測。
- 大片段重組：可偵測。
- 不適用範圍：
- 基因擴增 (Gene Amplification)：屬於拷貝數變異 (CNV)，通常以 qPCR、FISH 或晶片 (Array CGH) 檢測為主，RFLP 難以區分長度變化。
- 非位點突變：若點突變未發生在限制酶辨識序列上，RFLP 無法偵測（這是 RFLP 的主要局限性）。