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115年:(醫檢)檢驗(1)

序列特異性引子檢驗法（sequence specific primer-PCR）與特異性寡核苷酸試紙法（sequence specific oligonucleotide strip ）常用於檢測 HLA等位基因，關於此兩種檢測法的比較，下列敘述何者最不適當？

A序列特異性引子檢驗法所需檢測的時間較短
B序列特異性引子檢驗法可用於直接鑑別未知的HLA等位基因
C相較於序列特異性引子檢驗法，特異性寡核苷酸試紙法需要人工操作的步驟較少
D此兩種檢測法皆需要 positive control 組

詳細解析

本題觀念：

本題考查 HLA 分型技術中 序列特異性引子檢驗法 (Sequence Specific Primer-PCR, SSP-PCR) 與 特異性寡核苷酸試紙法 (Sequence Specific Oligonucleotide, SSO/SSOP) 的原理比較。

  1. SSP-PCR: 利用針對特定等位基因序列設計的引子 (Primer) 進行 PCR 擴增。若檢體含有該特定序列，PCR 產物便會生成（通常利用洋菜膠電泳觀察有無條帶）。
    • 特點：速度快（適合緊急移植，如大體捐贈）、需針對已知序列設計引子、單一樣本操作繁瑣（需多管 PCR）。
  2. SSO (SSOP): 先利用通用引子擴增 HLA 基因片段，再將產物與固定在載體（如試紙條、微珠）上的特異性探針 (Probe) 進行雜交。
    • 特點：適合大量篩檢（如骨髓資料庫）、通量高。

選項分析

  • A. 序列特異性引子檢驗法所需檢測的時間較短：敘述適當。 SSP-PCR 的流程為「PCR 擴增 -> 電泳判讀」，通常可在 2-4 小時內完成，因此常被用於需要快速報告的臨床情境（例如：大體腎臟移植的緊急配對）。相比之下，SSO 方法（特別是傳統試紙法）包含 PCR、雜交、洗滌、呈色等多個步驟，耗時較長。

  • B. 序列特異性引子檢驗法可用於直接鑑別未知的HLA等位基因：敘述最不適當。 SSP-PCR 的原理是基於「已知」的多型性序列來設計引子。如果檢體中存在一個**未知（新發現）**的 HLA 等位基因，其序列與現有的特異性引子不匹配，PCR 可能無法擴增或產生非預期的結果，導致無法判讀或誤判。SSP 無法直接定序，因此無法「直接鑑別」未知序列的結構。要鑑別未知或新的等位基因，必須使用 定序法 (Sequence Based Typing, SBT) 或 次世代定序 (NGS)。

  • C. 相較於序列特異性引子檢驗法，特異性寡核苷酸試紙法需要人工操作的步驟較少：敘述適當。 這裡比較的是操作繁瑣度。

    • SSP-PCR: 為了分辨 HLA 的多型性，單一個案通常需要進行數十個甚至近百個 PCR 反應（例如 96 孔盤），每個孔都需要精確加入 DNA 和特定的 Master Mix，且後續可能需要將所有孔產物進行電泳點樣，人工操作步驟（Pipetting）極多且繁瑣。
    • SSO 試紙法: PCR 階段通常只需 1-2 管（Multiplex PCR）。雖然試紙條的雜交過程（Hybridization/Wash）需要更換緩衝液，但相比於 SSP 需配製和點樣數十管 PCR，SSO 在前端準備的「人工操作步驟」通常被認為較少，且雜交步驟常有半自動化儀器（如 Auto-LIPA）輔助，適合批次處理。

  • D. 此兩種檢測法皆需要 positive control 組：敘述適當。 任何分子診斷實驗都需要品管。

    • SSP: 每個 PCR 反應管內通常會設計一對 內部控制引子 (Internal Control Primers)（如擴增 Human Growth Hormone 或 β-globin 基因），以確保 PCR 反應有成功進行，避免假陰性。此外，實驗室通常也會定期執行已知型別的陽性對照樣本 (Positive Control DNA) 來監控試劑效能。
    • SSO: 同樣需要陽性對照來確認雜交與呈色反應正常。

答案解析

選項 B 是錯誤的敘述。SSP-PCR 技術受限於引子設計，只能檢測「引子庫中涵蓋的已知序列」。對於全新的、未知的突變或等位基因，SSP 無法像定序法 (SBT/NGS) 那樣直接讀出序列並加以鑑別，只能給出無法判讀或錯誤的反應模式。

核心知識點

  1. HLA 分型方法比較：
    • SSP-PCR: 速度快（急件首選）、低通量、僅能測已知型別、引子特異性決定結果、內含 Internal Control。
    • SSO (SSOP): 高通量（大量篩檢首選）、適合批次處理、解析度中等。
    • SBT / NGS: 黃金標準 (Gold Standard)、高解析度、唯一能鑑定「未知/新」等位基因的方法、成本較高、耗時較長。
  2. 臨床應用：
    • 屍體捐贈移植 (Deceased Donor): 需分秒必爭，常用 SSP 或 Real-time PCR。
    • 骨髓庫建檔 (Registry): 需大量篩檢，常用 SSO 或 NGS。

參考資料

  1. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Chapter on HLA Typing.
  2. Profaizer, T., et al. (2024). "HLA Typing: Methods and Clinical Applications". Clinical Immunology.
  3. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI) Laboratory Manual.
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