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115年:(醫檢)檢驗(1)

下列何者最不需要利用 PCR技術進行真菌之分析鑑定？

A單股結構多型性
B多變數隨機重複序列分型法
C寡核苷酸陣列診斷
D質體分型法

詳細解析

本題觀念：

本題考查的是真菌分子鑑定與分型技術的原理，特別是各項技術對於聚合酶連鎖反應 (PCR) 的依賴程度。在醫事檢驗的分子診斷中，許多高靈敏度的檢測方法（如 SSCP、MLVA、Microarray）都需要先經過 PCR 擴增目標片段才能進行後續分析，而傳統的質體分析則主要依賴 DNA 萃取與電泳。

選項分析

  • A. 單股結構多型性 (Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP)：

    • 錯誤。此方法全名通常為 PCR-SSCP。
    • 原理：先利用 PCR 擴增出特定的 DNA 片段，將產物變性為單股 DNA，利用單股 DNA 在非變性膠體電泳中因序列不同導致二級結構（構形）差異，進而改變泳動速度來偵測點突變。
    • 結論：此技術的先決條件就是必須有 PCR 產物，因此高度依賴 PCR。

  • B. 多變數隨機重複序列分型法 (Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis, MLVA)：

    • 錯誤。
    • 原理：分析基因組中多個基因座的可變數目串聯重複序列 (VNTR)。由於重複次數不同導致片段長度不同，檢測時需先利用 PCR 針對這些重複區域進行擴增，再透過毛細管電泳定序分析產物大小以進行分型。
    • 結論：此為一種典型的 PCR-based 分型技術。

  • C. 寡核苷酸陣列診斷 (Oligonucleotide array diagnosis / Microarray)：

    • 錯誤。
    • 原理：將多種特異性的寡核苷酸探針固定在晶片上。為了達到足夠的檢測靈敏度，臨床樣本中的真菌 DNA（通常是 ITS 區域）通常需要先經過 PCR 擴增並標定（Labeling），再與晶片上的探針進行雜交（Hybridization）。雖然有少數不需擴增的直接雜交技術，但在臨床病原菌鑑定（特別是 Oligonucleotide array）的主流應用中，PCR 擴增是標準的前置步驟。
    • 結論：臨床應用上幾乎都需搭配 PCR 使用。

  • D. 質體分型法 (Plasmid typing / Plasmid profile analysis)：

    • 正確。
    • 原理：此方法主要分析真菌（如酵母菌）細胞內質體 (Plasmid) 的有無、大小或數量。傳統的質體分型是將細胞打破，萃取質體 DNA，直接進行瓊脂膠體電泳（Agarose gel electrophoresis）觀察其圖譜，或者經限制酶切割後進行 RFLP 分析。
    • 結論：此技術的核心在於DNA 的分離與純化，而非特定的片段擴增。雖然 PCR 可用於偵測特定質體基因，但在「質體分型」這個傳統定義下，它是一個基於萃取與電泳的技術，最不需要（或最不依賴）PCR 技術。

答案解析

答案：D

在上述選項中，SSCP、MLVA 和 Oligonucleotide array 本質上都是針對特定核酸序列進行分析，且為了訊號偵測或區分細微差異，標準流程中都必須包含 PCR 擴增步驟。反之，質體分型法 (Plasmid typing) 傳統上是基於質體 DNA 的物理分離與電泳觀察（Plasmid profile），不一定需要 PCR 擴增即可完成分型（例如直接比較質體條帶圖譜）。因此，D 是最不需要利用 PCR 技術的選項。

核心知識點

考生應掌握常見真菌分子鑑定技術的原理與分類：

  1. PCR-based 技術 (需擴增)：

    • PCR-SSCP：偵測點突變、序列差異。
    • MLVA：偵測 VNTR 重複次數（分型用）。
    • Oligonucleotide Array (晶片)：雜交前通常需 PCR 擴增 ITS 或特定基因以提高靈敏度。
    • RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)：使用隨機引子進行 PCR。
    • RFLP (若指 PCR-RFLP)：PCR 後再用限制酶切。

  2. Non-PCR / Extraction-based 技術 (直接分析 DNA)：

    • Plasmid Profiling：萃取質體 -> 電泳。
    • RFLP (傳統 Southern Blot)：萃取全基因組 -> 限制酶切 -> 南方墨點法 (需探針，不需 PCR，但耗時)。
    • PFGE (脈衝式電泳)：萃取完整染色體 DNA -> 特殊電泳分離大片段 (分型黃金標準，不需 PCR)。

  3. 質譜技術：

    • MALDI-TOF MS：分析蛋白質圖譜，完全不使用 PCR，是目前臨床鑑定菌種的主流快速方法。

參考資料

  1. Molecular Identification of Fungi. Clinical Microbiology Reviews. (關於各類分子鑑定技術的原理)
  2. Use of plasmid profiles and restriction endonuclease analysis of plasmid DNA for the identification of Candida. (關於質體分型法不需 PCR 的描述)
  3. 台灣醫事檢驗學會 - 分子檢驗技術相關教材.
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