檢測血中丙酮酸（pyruvate）時，利用乳酸去氫酶（lactate dehydrogenase）轉換成乳酸之方法，下列有關此方法的敘述，何者最不適當？

本題觀念：

本題考查的是臨床生化檢驗中，利用乳酸去氫酶 (Lactate Dehydrogenase, LDH) 測定血中 丙酮酸 (Pyruvate) 濃度的原理與檢體處理注意事項。

檢測原理為以下反應： $\text{Pyruvate} + \text{NADH} + \text{H}^+ \xrightarrow{\text{LDH}} \text{Lactate} + \text{NAD}^+$

在此反應中，利用 NADH 在 340 nm 有吸光度，而 NAD+ 無吸光度的特性，監測 340 nm 吸光度的下降速率（因為 NADH 被消耗），藉此定量丙酮酸的濃度。

選項分析

• A. 反應於 pH 7.5 下進行：適當。
  • LDH 催化的反應是可逆的。反應方向取決於 pH 值：
    • 乳酸 $\rightarrow$ 丙酮酸 (L $\rightarrow$ P)：適合在鹼性環境（pH 8.8 ~ 9.8）進行，以利於生成 NADH。
    • 丙酮酸 $\rightarrow$ 乳酸 (P $\rightarrow$ L)：即本題測量丙酮酸的方向，反應平衡傾向於生成乳酸，通常在中性或弱酸/弱鹼性環境（約 pH 6.0 ~ 7.5）下進行，許多試劑組設定在 pH 7.5 左右。
• B. 反應所需的輔酶為 FADH2：不適當 (錯誤選項)。
  • LDH 是典型的 NAD+/NADH 依賴型氧化還原酶。
  • 在測定丙酮酸時，必須加入 NADH 作為輔酶（Coenzyme/Substrate），使其氧化為 NAD+。FAD/FADH2 並非此反應的輔酶。
• C. 反應以 340 nm 吸光度進行測定：適當。
  • NADH 在紫外光 340 nm 處有最大吸收峰，而氧化態的 NAD+ 在此波長無吸收。
  • 測定過程中，隨著丙酮酸被還原成乳酸，NADH 減少，因此檢測 340 nm 吸光度的下降量。
• D. 檢體以冰浴或低溫方式傳送，並於 15 分鐘內分離血漿：適當。
  • 丙酮酸在全血中非常不穩定。紅血球會持續進行糖解作用 (Glycolysis)，將葡萄糖轉化為丙酮酸（隨後轉為乳酸），導致檢體中的丙酮酸濃度在採血後迅速假性升高。
  • 因此，標準採檢流程要求：使用含有蛋白沈澱劑（如過氯酸）的管子立即去蛋白，或者使用冰浴（4°C）運送並在極短時間內（如 15~30 分鐘內）離心分離血漿，以抑制酵素活性。

答案解析

選項 B 最不適當。乳酸去氫酶 (LDH) 的反應機制絕對依賴 NAD+/NADH 系統，與 FADH2 無關。

核心知識點

1. LDH 測定原理：
   • P $\rightarrow$ L (測 Pyruvate)：pH ~7.5，消耗 NADH，測 340 nm 下降。
   • L $\rightarrow$ P (測 Lactate 或 LDH 活性)：pH ~9.0，生成 NADH，測 340 nm 上升。
2. 檢體處理 (Pyruvate)：極不穩定，需冰浴送檢並立即分離或立即去蛋白 (Deproteinization)，防止紅血球糖解作用造成假性升高。
3. 輔酶：LDH 使用 NAD+/NADH。

參考資料

1. Linear Chemicals. LDH BR - Lactate dehydrogenase Kinetic spectrophotometric method. [說明書提及 P$\rightarrow$L 反應於 pH 7.5 進行]
2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Carbohydrates.
3. 衛生福利部臺中醫院. 檢驗項目-Pyruvate. [提及檢體需冰浴送檢]