使用HPLC分析serine時，下列何種策略最不合適？

本題觀念：

本題主要考查 胺基酸（Amino Acids）的理化性質 與 HPLC 層析分離機制 的搭配。

1. 分析物性質：Serine (絲胺酸) 是一種極性（polar）、親水性（hydrophilic）的胺基酸。其側鏈為羥基 (-OH)，等電點 (pI) 約為 5.68。
   • 在酸性環境 (pH < pI) 下：帶正電 (Cation)。
   • 在鹼性環境 (pH > pI) 下：帶負電 (Anion)。
2. 層析管柱原理：
   • C18 (逆相層析)：利用疏水性作用力 (Hydrophobic interaction) 分離非極性化合物。
   • HILIC (親水性交互作用層析)：專門用於分離極性、親水性化合物。
   • 離子交換 (Ion Exchange)：利用電荷吸附原理，陽離子交換柱吸附正離子，陰離子交換柱吸附負離子。

選項分析

• A. 使用酸性的移動相，搭配 C18管柱進行分析 (最不合適)

  • 分析：在酸性移動相中，Serine 的胺基被質子化 ($NH_3^+$)，使分子帶正電且極性極高。C18 管柱的固定相是長鏈烷基，具有高度疏水性。
  • 結果：極性的 Serine 與非極性的 C18 固定相之間缺乏作用力（"Like dissolves like" 原理，極性不相容）。若不進行衍生化 (Derivatization) 或加入離子對試劑 (Ion-pairing reagent)，Serine 幾乎不會被 C18 保留，會隨著溶劑前沿 (Dead volume, $t_0$) 直接沖出，無法進行有效分離與定性定量。這是分析未衍生化親水性胺基酸最無效的策略。

• B. 使用鹼性的移動相，搭配 HILIC 管柱進行分析

  • 分析：HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) 專門設計用於保留極性化合物。
  • 結果：Serine 是親水性分子，在 HILIC 模式下，會在固定相表面的水層中進行分配或透過氫鍵/靜電作用被保留。鹼性條件下 Serine 可能帶負電，但 HILIC 對帶電及極性分子皆有良好的保留能力，是分析極性代謝物的常用策略。

• C. 使用酸性的移動相，搭配陽離子交換管柱進行分析

  • 分析：在酸性移動相 (pH < pI) 中，Serine 帶正電 ($NH_3^+$)。
  • 結果：帶正電的 Serine 會被帶負電的「陽離子交換樹脂 (Cation Exchange)」吸附並保留。這正是傳統 胺基酸分析儀 (Amino Acid Analyzer) 的標準運作原理（使用陽離子交換柱搭配 pH 梯度沖提），是非常成熟且合適的策略。

• D. 使用鹼性的移動相，搭配陰離子交換管柱進行分析

  • 分析：在鹼性移動相 (pH > pI) 中，Serine 的羧基解離 ($COO^-$) 且胺基去質子化，使分子帶負電。
  • 結果：帶負電的 Serine 會被帶正電的「陰離子交換樹脂 (Anion Exchange)」吸附。這也是常見的分析策略之一（例如 HPAEC-PAD 高效陰離子交換層析搭配脈衝安培偵測器），適用於碳水化合物與胺基酸分析。

答案解析

答案為 (A)。 Serine 為高極性小分子，在逆相層析 (RP-HPLC, C18) 的酸性條件下，因其帶正電且親水性極強，與疏水性的 C18 固定相幾乎無交互作用，會導致無保留 (No retention) 現象，無法達成分析目的。若要在 C18 上分析 Serine，通常必須先進行衍生化（如 OPA, FMOC 衍生）以增加疏水性，或在移動相中加入離子對試劑（如烷基磺酸鹽）。單純使用酸性移動相與 C18 是最不合適的策略。

核心知識點

1. 胺基酸分析策略總結：
   • 離子交換法 (IEC)：利用 pH 控制胺基酸帶電狀態 (酸性+用陽離子柱；鹼性-用陰離子柱)。
   • 親水性作用層析 (HILIC)：直接分析未衍生化的極性胺基酸。
   • 逆相層析 (RP-HPLC)：必須搭配 衍生化 (Derivatization) 或 離子對試劑 (Ion-pairing) 才能分析親水性胺基酸。
2. pH 與保留行為：
   • Cation Exchange: pH < pI (Analyte +)
   • Anion Exchange: pH > pI (Analyte -)
   • Reverse Phase (C18): 僅保留非極性 (疏水性) 分子。

參考資料

1. HPLC Methods for analysis of Serine - HELIX Chromatography
2. Separation of Amino Acids on C18 Column - ResearchGate Discussion
3. Skoog, D. A., et al. Principles of Instrumental Analysis. (層析原理與管柱選擇章節)