以ODS HPLC 分析bupivacaine （pKa 8.1），移動相為乙腈/Tris buffer（pH 8.4）＝40/60，流速1.0mL/min，to為2.3 min，tR為17.32 min 。下列何種分析條件的變動可能使樣品有更長的滯留時間？

本題觀念：

本題考查 逆向層析 (Reverse Phase HPLC, RP-HPLC) 的滯留行為原理，特別是流速、移動相組成、溫度及 pH 值對鹼性藥物（bupivacaine）滯留時間 ($t_R$) 的影響。

在 RP-HPLC 中，固定相 (Stationary Phase) 為非極性（如 C18/ODS），移動相 (Mobile Phase) 為極性（如緩衝液+乙腈）。

• 基本原則：分析物的極性越低（越脂溶性），與固定相作用越強，滯留時間越長；反之，極性越高或離子化程度越高，則滯留時間越短。

選項分析：

• A. 乙腈的百分率提高到60％：錯誤

  • 乙腈 (Acetonitrile, ACN) 是有機修飾劑，屬於 RP-HPLC 中的「強溶劑」。
  • 增加有機溶劑比例會降低移動相的極性，使其更接近非極性固定相的性質，導致分析物的沖提能力 (Elution strength) 增強。
  • 結果：分析物會更快被沖洗出來，滯留時間縮短。

• B. 流速更換成 0.8 mL/min：正確

  • 滯留時間 ($t_R$) 與流速 ($F$) 成反比關係。公式概念為：$t_R = \frac{V_R}{F}$（其中 $V_R$ 為滯留體積）。
  • 將流速由 1.0 mL/min 降低至 0.8 mL/min，表示移動相流動變慢，分析物通過管柱所需的時間自然增加。
  • 結果：滯留時間變長。

• C. 升高分析溫度：錯誤

  • 層析管柱中的分配平衡通常是放熱反應，升高溫度會降低分配係數 (K)，使分析物更傾向分佈於移動相中。此外，高溫會降低移動相黏度，加快質量傳遞。
  • 結果：通常會導致滯留時間縮短。

• D. buffer的pH值調整為 7.4：錯誤

  • 分析物性質：Bupivacaine 為鹼性藥物，pKa = 8.1。
  • 原始條件 (pH 8.4)：pH > pKa。根據 Henderson-Hasselbalch 方程式，環境 pH 高於 pKa 時，鹼性藥物主要以 未解離態 (Unionized, B) 存在。未解離態極性低（脂溶性高），與 C18 固定相作用力強，滯留時間長。
  • 變動條件 (pH 7.4)：pH < pKa。環境 pH 低於 pKa 時，鹼性藥物主要以 解離態/離子態 (Ionized, BH⁺) 存在。離子態極性高（水溶性高），與非極性固定相作用力弱。
  • 結果：分析物會更快隨極性移動相流出，滯留時間縮短。

答案解析

欲使滯留時間變長，需增加分析物與固定相的作用力，或直接降低推動流體的速度。

• 選項 A、C、D 均會導致滯留時間縮短。
• 唯有 選項 B (降低流速) 會直接因物理流速減慢而增加滯留時間。

故正確答案為 (B)。

核心知識點

1. RP-HPLC 滯留時間影響因子總結：
   • 增加滯留時間 ($t_R \uparrow$)：降低流速、降低有機溶劑比例 (極性 $\uparrow$)、降低溫度、調整 pH 使藥物呈未解離態（酸性藥 pH < pKa；鹼性藥 pH > pKa）。
   • 減少滯留時間 ($t_R \downarrow$)：增加流速、增加有機溶劑比例 (極性 $\downarrow$)、升高溫度、調整 pH 使藥物呈離子態。
2. pH 對離子化藥物的影響：
   • 鹼性藥 (Basic drugs)：pH 下降 $\rightarrow$ 離子化增加 $\rightarrow$ 極性增加 $\rightarrow$ 在 RP-HPLC 中 $t_R$ 縮短。
   • 酸性藥 (Acidic drugs)：pH 上升 $\rightarrow$ 離子化增加 $\rightarrow$ 極性增加 $\rightarrow$ 在 RP-HPLC 中 $t_R$ 縮短。

參考資料

1. Chromatography Today: Impact of flow rate on retention time - 確認流速與滯留時間的反比關係。
2. Shimadzu Application News: Effect of mobile phase pH on reversed-phase HPLC separations of ionizable compounds - 確認 pH 對鹼性藥物滯留行為的影響。
3. NIH / PubMed: Physicochemical properties of local anesthetics (Bupivacaine pKa) - 確認 Bupivacaine 之 pKa 與脂溶性特性。