分析檢品 A與B得到兩個逆相高效液相層析圖（ 1與2），下列何種操作絕對無法由層析圖1得到層析圖2？

本題觀念：

逆相高效液相層析 (RP-HPLC) 之滯留時間 ($t_R$) 與分離參數的影響因素。主要涉及以下核心觀念：

1. 溫度對滯留時間的影響：溫度升高，移動相黏度降低，分析物在移動相與固定相間的質量傳遞速率增加，通常會導致滯留時間縮短。
2. 移動相組成對滯留時間的影響：在逆相層析中，降低有機相比例（即增加水相/極性比例），會使非極性分析物更傾向分佈於固定相，導致滯留時間延長。
3. 流速對滯留時間的影響：流速降低，分析物通過管柱的時間成比例增加，滯留時間延長。
4. 選擇性 ($\alpha$)：改變移動相組成或管柱種類會改變選擇性；單純改變流速通常不改變選擇性（即波峰的相對位置比例不變）。

影像分析：

1. 圖1 (左)：
   • 波峰 A 滯留時間 $t_R = 8.9$ 分鐘。
   • 波峰 B 滯留時間 $t_R = 9.65$ 分鐘。
   • 兩峰距離較近，分離度較小。
2. 圖2 (右)：
   • 波峰 A 滯留時間 $t_R = 10.9$ 分鐘。
   • 波峰 B 滯留時間 $t_R = 13.2$ 分鐘。
   • 關鍵變化：滯留時間顯著延長 (向右移動)，且兩峰之間的分離度 (Resolution) 變大，波峰間距拉開的程度大於單純的時間放大（暗示選擇性 $\alpha$ 可能發生了變化）。

選項分析：

• A. 更換管柱：
  • 更換為不同固定相（如 C8 換成 C18）或更長的管柱，完全可能改變滯留行為、選擇性及滯留時間。若換成保留力更強的管柱，滯留時間會延長，且分離效果可能改變，可能得到圖2。
• B. 升高分析管柱溫度：
  • 分析：在 RP-HPLC 中，升高溫度通常會降低 $k'$ (容量因子)，使分析物更快沖提出來（滯留時間 $t_R$ 縮短）。
  • 比對影像：圖1 到 圖2 的變化是滯留時間延長 (8.9 $\to$ 10.9 min)。
  • 結論：升高溫度會導致時間變短，與圖中時間變長的方向完全相反。因此，此操作絕對無法由圖1得到圖2。
• C. 降低有機相比例：
  • 分析：降低有機溶劑（如 Methanol/ACN）比例，即增加水相，會增加移動相的極性。在逆相層析中，這會使疏水性分析物更難溶於移動相，而更強烈地吸附在固定相上，導致滯留時間延長。同時，改變溶劑組成通常會改變選擇性 ($\alpha$)，有助於改善分離度。
  • 比對影像：符合滯留時間延長及分離度改善的特徵，可能得到圖2。
• D. 降低流速：
  • 分析：降低流速會直接導致滯留時間成比例延長。
  • 比對影像：雖然單純降低流速理論上不會改變選擇性 $\alpha$（波峰相對間距比例應固定），但其對滯留時間的影響方向（變長）與圖2一致。相較於選項 B 的「方向完全相反」，選項 D 在時間方向上是吻合的（儘管圖2的選擇性變化暗示 D 可能不是唯一原因，但 B 是物理上絕對矛盾的）。
  • 考試技巧：在「絕對無法」的考題中，通常優先選擇作用方向相反的選項。B 導致時間縮短，而圖示為時間延長，故 B 為正解。

答案解析

正確答案：B

由圖1至圖2，最明顯的變化是滯留時間 ($t_R$) 顯著增加（由 8-9 分鐘延後至 10-13 分鐘）。

• 選項 B (升高溫度)：根據凡特荷夫方程式 (van't Hoff equation) 概念及層析實務，升高溫度會降低分析物與固定相的交互作用力，導致滯留時間縮短。這與圖中滯留時間延長的結果完全背道而馳，因此絕對不可能造成此變化。
• 選項 C (降低有機比) 與 D (降低流速) 均會使滯留時間延長，方向上與圖示變化一致。

核心知識點

1. 溫度效應：HPLC 溫控箱溫度 $\uparrow$ $\rightarrow$ 黏度 $\downarrow$、質傳速率 $\uparrow$、滯留時間 $\downarrow$ (出峰變快)、管柱壓力 $\downarrow$。
2. 流速效應：流速 $\downarrow$ $\rightarrow$ 滯留時間 $\uparrow$ (出峰變慢)，通常不改變選擇性 ($\alpha$)。
3. 溶劑效應 (逆相)：有機相% $\downarrow$ (極性 $\uparrow$) $\rightarrow$ 滯留時間 $\uparrow$ (出峰變慢)，通常可改善分離度。

參考資料

1. Chromatography Today - The Use of Temperature for Method Development in LC.
2. ThermoFisher - How Does Column Temperature Affect HPLC Resolution?
3. 藥師國考歷屆試題解析 (藥物分析).